Advanced Science | 武汉大学肖璇/周宇/陈婷团队揭示ASCAL构建小鼠眼部空间单细胞图谱及RAO动态的分子机制
- 2026-10-08 19:17:12
Advanced Science | 武汉大学肖璇/周宇/陈婷团队揭示ASCAL构建小鼠眼部空间单细胞图谱及RAO动态的分子机制
视网膜动脉阻塞（RAO）是眼科急症，可在短时间内造成严重视功能损伤，其病理过程涉及缺血缺氧、神经元损伤、胶质反应和免疫激活。眼球本身结构高度分层，视网膜、睫状体、角膜、巩膜和晶状体等区域细胞组成差异显著，传统单细胞RNA测序虽然能解析细胞异质性，却丢失空间位置信息；空间转录组能够保留组织坐标，但又常受细胞分割误差、捕获效率低和成本高限制。如何用有限空间切片对大规模单细胞数据进行可靠注释和定位，是构建眼部图谱和理解RAO病灶空间动态的关键缺口。 2026年6月1日，武汉大学生命科学学院陈婷教授、周宇教授和肖璇教授团队在国际知名期刊 《Advanced Science》在线发表了题为”Single-Cell Annotation and Localization via Integrating Spatial Transcriptomics Maps the Mouse Ocular Atlas and RAO Dynamics”的研究论文。研究团队开发了ASCAL（Automated Single-Cell Annotation and Localization）流程，将单核分辨率SeekSpace和覆盖更均一的Stereo-seq结合：SeekSpace提供带有空间依据的细胞类型表达参考，Stereo-seq提供高覆盖空间定位参考，再用eClassifier、CytoSPACE和TopACT把大规模scRNA-seq细胞自动注释并映射回组织空间。借助这一策略，作者构建了小鼠全眼单细胞空间图谱，并在Apoe缺失背景的UPOAO模型中解析RAO动态，提出“内层视网膜免疫激活 + 外层活跃Rod亚群选择性丢失”的空间病理模型，为RAO机制研究提供了更细粒度的细胞坐标。 
研究团队先用SeekSpace在3张小鼠眼部冷冻切片上构建单细胞分辨率空间参考，获得17,835个细胞，数据中每个细胞的UMI中位数为413，基因数中位数为254。SeekSpace通过空间条形码和单核测序避免依赖图像分割或解卷积，能够把细胞重新映射回组织坐标并重建眼部解剖形态。作者将细胞划分为37个无监督聚类，结合经典标记基因和解剖位置进行注释：视网膜细胞使用Pax6、Vsx2、Pde6a、Slc17a6、Onecut2、Pde6c等标记识别AC、BC、Rods、RGC、HC和Cones，胶质细胞使用Vim、Mbp、Itgam等标记；对于晶状体、睫状体等缺少经典标记的非视网膜组织，则依据SeekSpace空间坐标和小鼠眼组织学位置确定身份。最终注释出6类视网膜细胞、3类胶质细胞和8类其他细胞，并通过空间邻域富集分析证明转录组聚类能够重建AC/BC突触层、角膜基质-上皮模块等原位共定位结构。 
图1：SeekSpace构建小鼠全眼单细胞空间注释参考 为了摆脱人工标记基因注释的主观性，作者基于SeekSpace图谱训练支持向量机模型eClassifier，用于自动识别眼部scRNA-seq细胞类型。验证数据包括团队获得的视网膜单细胞数据，以及公开的睫状体相关区域数据GSE178667。考虑到组织切片捕获的外周免疫细胞较少，研究团队先用已验证标记基因补充注释外周免疫细胞，再用eClassifier注释其余细胞。结果显示，几乎每个无监督聚类中的细胞都具有一致的预测标签；在标签校正流程中，超过86%的细胞身份在校正前后保持一致。细胞组成也符合解剖预期：睫状体、巩膜和外周免疫细胞在睫状体相关样本中比例更高，而Rods在视网膜样本中占主导。这说明空间引导的参考图谱可以作为跨眼部区域单细胞注释的可靠“坐标尺”。 
图2：基于SeekSpace参考的eClassifier实现跨眼部区域自动细胞注释 SeekSpace提供单细胞分辨率，但冷冻切片质量和细胞核完整性会限制捕获覆盖度，因此作者又在4张小鼠眼部切片上进行Stereo-seq，构建更完整的空间参考。以bin50作为空间单元时，每个bin50 spot检测到的UMI中位数为2,551，基因数中位数为770。Stereo-seq聚类结果与眼部解剖高度一致，视网膜可分为神经节细胞层、内核层、外核层和色素上皮层等4个层状区域。与SeekSpace相比，Stereo-seq在非视网膜区域覆盖更均一，68%的spots位于非视网膜区域，主要分布于角膜和巩膜；SeekSpace检测到的非视网膜细胞比例仅为21%。在严格fold change cutoff为4时，Stereo-seq仍能识别大量非视网膜组织特异基因，并且功能注释与对应解剖结构相吻合。用SeekSpace注释细胞类型作为参考对Stereo-seq bin50 spots进行解卷积后，视网膜spots主要对应Rods、RGCs、ACs和BCs，非视网膜区域则映射到相应基质和免疫细胞，验证了两种空间平台之间的一致性。 
图3：Stereo-seq补足全眼空间覆盖并作为空间定位参考 在空间定位层面，作者用CytoSPACE把SeekSpace来源的细胞类型投射到Stereo-seq切片上，并利用眼球近似左右对称的特点，将后续分析聚焦于半个眼球以提高计算效率。该整合生成了高覆盖的小鼠眼部空间图谱，各细胞类型与解剖位置高度吻合。对于外周免疫细胞这类稀有、弥散分布且难以直接定位的细胞，研究团队进一步使用TopACT进行概率定位，并设置0.6和0.7两个置信阈值。结果显示，外周免疫细胞在特定非视网膜区域呈稀疏定位，映射到视网膜区域的比例很低：阈值0.7时仅2.25%，阈值0.6时为5.59%。CD14免疫荧光验证也显示，外周免疫细胞主要限制在眼外肌和周围结缔组织中，视网膜层内几乎没有可检测信号。这一结果既符合血-视网膜屏障的生理特性，也证明ASCAL能够定位稀有细胞而不夸大其在视网膜中的存在。 
图4：基于Stereo-seq重建单细胞空间定位并验证稀有免疫细胞分布 随后，作者将ASCAL用于RAO模型解析。研究团队在Apoe敲除小鼠中采用UPOAO建立RAO模型，并对RAO和对照视网膜组织进行scRNA-seq；该数据每个细胞UMI中位数为2,001，基因数中位数为1,188。整合Apoe KO和野生型视网膜数据后，批次效应被有效去除，Apoe表达在KO样本中显著降低，说明模型和数据处理可靠。eClassifier在排除Apoe基因后仍能稳健注释KO数据，并发现无监督聚类遗漏了Müller胶质细胞：它们分散在聚类10和14中，但Vim表达显著高于同簇其他细胞。作者采用混合注释策略，保留聚类10和14中的eClassifier结果，其余聚类按主导细胞类型标注，并去除数量少于50的细胞类型。系统参数扫描显示，eClassifier注释的Müller胶质细胞与任何无监督聚类的Jaccard指数最高仅0.04，说明标准聚类很难单独识别这种转录差异细微的细胞群。 
图5：ASCAL识别无监督聚类遗漏的Müller胶质细胞 RAO诱导的免疫激活呈现明确空间偏向。细胞比例分析显示，RAO后小胶质细胞和Müller胶质细胞扩增；Müller胶质细胞具有最多显著差异基因，上调基因富集于翻译调控和应激反应。UPOAO模型通过眼底照相和ERG验证：模型眼出现视网膜血管变窄、动脉发白、静脉血流停止等阻塞表型，ERG中a波和b波振幅显著下降，且7天损伤重于3天。Stereo-seq显示Müller胶质标记Vim并非弥散背景，而是富集于GCL和INL；RAO后Vim在3天时已于GCL升高，7天时在GCL和INL均更显著，其中GCL最突出。小胶质细胞标记在spot层面较弱，作者用TopACT定位snRNA-seq细胞，发现RAO 7天样本中预测小胶质热点比对照增加超过10倍，且主要集中在GCL。IBA1免疫荧光进一步证明RAO后小胶质细胞向内层视网膜迁移，inner score显著升高，并出现突起缩短、增粗、分枝减少等激活形态。 
图6：RAO诱导的免疫激活主要定位于视网膜神经节细胞层 在神经元变化方面，RAO后RGC减少，ERG b波下降也对应BC损伤；相比之下，Rods总量变化最小，但UMAP提示Rod内部亚群比例发生重排。作者利用SeekSpace的空间单细胞能力重新分析Rod亚群，共识别出5个Rod亚群，其中C5弥散分布而被排除在后续空间分析之外。剩余亚群，尤其C1和C4，呈现不同层状定位：通过拟合眼球中心并计算细胞到中心的径向距离，Wilcoxon检验证明C1更外周，C4更靠近中心；两个半球之间也有不对称分布，半球1中C4更多，半球2中C1比例更高。由于SeekSpace通量有限，作者进一步从scRNA-seq中提取Rod细胞，用基于SeekSpace Rod亚群训练的eClassifier分类，并发现Rbp3在C1亚群中特异表达。RNAscope验证显示，Rbp3信号与泛Rod标记Pde6a共定位于视网膜核层，但Rbp3相对Pde6a更靠外侧，这一外周定位在野生型、Apoe KO和RAO切片中均可观察到。 
图7：Rod亚群具有可验证的空间分层分布 进一步分析发现，C1 Rod亚群不仅位置特殊，也代表一种功能更活跃的状态。除Rbp3外，C1标记基因显著富集于翻译相关生物过程，包括Rps15a等多个核糖体蛋白基因，提示该亚群可能具有更高蛋白合成活性。eClassifier对scRNA-seq中Rod亚群的注释显示，RAO后C1比例明显下降；用CytoSPACE把CON和RAO单细胞分别映射到7天Stereo-seq切片后，对照视网膜中C1占主导，而RAO切片中C4显著出现。公开RAO视网膜bulk RNA-seq数据也显示，多个C1标记基因在RAO 7天显著下调。RNAscope独立验证了这一结论：与对照相比，RAO后WT小鼠Rbp3信号明显减少；以DAPI核数归一化后，Rbp3阳性比例下降近一半。由此，ASCAL揭示RAO并未简单消耗全部Rods，而是选择性损伤外层、翻译活跃、Rbp3阳性的C1 Rod状态。 
图8：RAO选择性耗竭功能活跃的C1 Rod亚群 研究揭示ASCAL通过整合SeekSpace、Stereo-seq和scRNA-seq，实现了小鼠眼部细胞的自动注释与空间定位，并揭示RAO病理具有明确空间分层。在RAO中，这一框架进一步解析出GCL富集的Müller胶质和小胶质免疫激活，以及外层Rbp3+、翻译活跃Rod C1亚群的选择性丢失。这项研究的价值不只是给出小鼠全眼空间图谱，更重要的是说明疾病中的“细胞变化”必须放回组织位置中理解，为RAO及相关视网膜缺血疾病提供了新的空间病理框架。 原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.75857 文献简报 Plant Commun | 浙江大学关雪莹团队揭示lncRNA NEXUS增强棉花抗旱性分子机制 PBJ | 中国农业大学沈杰/闫硕团队揭示互作型内吞与跨膜运输协同防治破坏性植物病害 Plant Commun | 北京林业大学陆海团队揭示拟南芥形成层细胞增殖与木质部分化分子机制 重磅Nature！ | 清华大学方晓峰团队揭示细胞水势感知蛋白SAM8通过生物分子凝聚调控植物渗透胁迫适应 Plant Commun | 南京农业大学万建民/王春明团队揭示水稻耐盐性与籽粒蛋白积累分子机制 Plant Commun | 华中农业大学吴昌银团队揭示调控水稻穗腋生分生组织形成分子机制 Mol Plant | 浙江大学团队揭示植物线粒体逆行信号整合代谢、环境与激素信号调控发育与生长分子机制 Hortic Res | 华中科技大学与农科院油料所团队揭示茎秆木质纤维素合成的协同调控网络
本文来自网友投稿或网络内容，如有侵犯您的权益请联系我们删除，联系邮箱：wyl860211@qq.com 。
