Nature | 中国科学院武汉病毒研究所龚鹏/王曼丽团队在CCHFV复制机制与核苷类抑制剂发现研究中取得领域突破

克里米亚-刚果出血热是一种高致死蜱传病毒，目前全球没有获批专用抗病毒药物，病毒体内负责基因组复制的 L 蛋白是理想药物靶点，但该蛋白拥有近 4000 个氨基酸，属于已知体积最大病毒聚合酶，完整三维结构始终缺失，也缺少能精准阻断它的小分子。本研究借助冷冻电镜解析全长蛋白多状态高分辨结构，完整还原病毒 RNA 早期、晚期延伸全过程，同时借鉴丙肝特效药索非布韦的核糖改造思路，筛选出仅对该病毒起效的核苷类似物，区分开同目其他出血热病毒聚合酶，补齐该病原基础研究与药物筛选双重短板。

研究成果以“RNA synthesis and substrate analog inhibition in the CCHFV polymerase”（CCHFV聚合酶中的RNA合成与底物类似物抑制）为题发表在 Nature，中国科学院武汉病毒研究所龚鹏、王曼丽为其通讯作者。

CCHFV 全长 L 蛋白整体分区与多状态冷冻电镜构象

开展这部分实验是为补齐该巨型聚合酶无完整三维结构的空白，区分空载、结合 5'cRNA、RNA 延伸复合物三种生理构象，划分与近缘病毒对应的三大功能区域。结果显示全长 L 蛋白共 3945 个氨基酸，分为 PA 样、PB1 样（RdRP）、PB2 样三大区段，相比流感、拉克罗斯病毒多出大片专属插入序列。3.0 埃分辨率 EC14 延伸复合物覆盖 78.4% 氨基酸残基，完整捕获模板、产物、5' 启动子 RNA 结合状态，蛋白整体呈蝴蝶形态，RdRP 构成主体，两侧分别为 PA 样、PB2 样侧翼区域。电镜图能观测锌、锰金属离子稳定催化口袋，同时观测两套额外 RNA 分子分别结合 UPD、内切酶区域，对应产物上游、非引物 RNA 结合模式，完整呈现启动子 hook 识别的保守特征，也展现内罗病毒独有的蛋白插入带来全新 RNA 结合通道。

Figure 1、CCHFV L蛋白整体结构与分区。a CCHFV、拉克罗斯病毒、流感聚合酶区域分区示意图，右侧为纯化蛋白电泳。b EC14 冷冻电镜密度图，180 度正反视角展示蛋白与 RNA、金属离子。c EC 组装 RNA 产物变性胶。d PA、RdRP、PB2 三大区域卡通结构，与拉克罗斯病毒叠加对比。

FID 手指插入域拓展下游模板结合通路

解析 FID 结构是为弄清该 329 个氨基酸大片插入对 RNA 合成的作用，电镜数据拆分出 FID 完整折叠、FID 无序两类颗粒群体用于对比。结构显示 FID 位于 RdRP 活性位点下游，形成球状折叠，一侧与内切酶结构产生疏水、氢键相互作用，另一侧和 PA-C 样结构围成高正电核酸结合沟槽，沟槽富集赖氨酸、精氨酸残基用于结合模板 RNA。EC14b 构象中 FID 密度完整，能观测带状电镜密度横跨 FID 与 PA-C 之间，对应下游长链模板 RNA 结合轨道。突变实验靶向沟槽碱性残基、FID - 内切酶互作位点改造，微型基因组荧光数据显示突变后病毒复制水平大幅下降，直接证实 FID 通过稳定下游模板 RNA 提升聚合酶持续合成能力，是病毒合成超长转录本必需元件。

Figure 2、FID与UPD结构及分子互作。a EC14a（FID 缺失密度）与 EC14b（完整 FID 密度）对比。b FID 周边表面静电势，标记 RNA 结合碱性残基。c FID 与内切酶互作界面。d CCHFV 内切酶整体结构。e CCHFV 与发热伴血小板减少综合征病毒内切酶 RNA 结合对比。f UPD 介导上游产物 RNA 通道。g 产物通道静电分布。h T38b RNA 与 UPD 疏水残基结合细节。

UPD 结构域搭建上游产物 RNA 释放通道

设置 UPD 相关结构观测与突变实验，用来解释病毒新生 RNA 如何从聚合酶上游顺利脱出，UPD 是内罗病毒另一独有插入片段。结构显示 UPD 位于 PB2 样区段前端，和 Mid-linkU 形成大面积互作界面，同时依靠 EndoNE 内切延伸片段三方交联，组装成类似罩子的包裹结构，环绕保守夺帽功能模块。一条连续高正电通道贯穿 CBD 帽结合区、Mid-link、UPD，新生单链产物 RNA 沿这条通道排出，电镜可观测 T38b 模板双链单链交界固定在 UPD 表面，疏水氨基酸堆叠稳定核糖与碱基。针对 UPD 和 RNA、Mid-link 互作位点设计 M8 至 M14 系列突变，细胞微型基因组实验显示破坏 UPD-RNA 结合的突变复制活性不足野生型 20%，证明 UPD 是上游产物 RNA 转运核心元件，和 FID 配合实现长链 RNA 全程锚定。

Figure 3、突变微型基因组功能验证。a CCHFV 特有 UPD、FID 形成的限制性互作网络，对比拉克罗斯病毒结构。b 14 组突变体校正后 eGFP 荧光定量，下方为 L 蛋白免疫印迹。下游突变组靶向 FID、PI 互作，上游突变组靶向 UPD-RNA、UPD-Mid-link 互作，-L 为无 L 蛋白阴性对照，*** 代表统计学极显著差异。

2' 修饰核苷类似物仅特异性抑制 CCHFV 聚合酶

开展多套体外 RdRP 酶活实验，验证索非布韦同源核糖修饰核苷（XNTP）的选择性抑制效果，同步纳入拉沙、裂谷热同目病毒聚合酶做平行对照。凝胶电泳结果显示 XCTP、XGTP、XUTP、XATP 四类核苷三磷酸均可被 CCHFV 聚合酶掺入 RNA 链，掺入后立刻终止延伸，不会产生更长产物；同等浓度下拉沙、裂谷热聚合酶完全无法识别、掺入该类分子。其他对照核苷如吉西他滨三磷酸、莫努匹韦三磷酸无特异性链终止效果，3'、2' 脱氧核苷仅广谱阻断三类病毒。底物竞争实验固定 100μM XNTP，梯度添加天然 NTP，XUTP 与丙肝索非布韦体系抑制水平相近，XCTP 竞争天然 CTP 能力最弱，四种碱基修饰分子均保留专一靶向 CCHFV 的特性，证实核糖 2'α 氟 - 2'β 甲基改造是开发抗 CCHFV 专属抑制剂的核心骨架。

Figure 4、核苷类似物体外RdRP抑制凝胶结果。a 四类 RNA 体外合成模板序列。b 四种 XNTP 对 CCHFV 聚合酶抑制电泳。c XNTP 与天然 NTP 竞争凝胶，右侧附 HCV 索非布韦对照。d 四种 XNTP 相对掺入定量柱状图。红色三角代表核苷类似物掺入终止产物条带，M 为核酸长度标记，XC/XG/XU/XA 对应胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷修饰三磷酸。

CCHFV 完整 RNA 复制四阶段工作模型

整合全部结构与酶活数据搭建完整复制循环模型，梳理聚合酶从启动子识别到整条基因组合成全过程构象变化。复制起始阶段聚合酶识别 vRNA 启动子 hook，3' 模板进入活性中心；起始向延伸转换时引发环 PE 参与双链稳定；早期延伸阶段盖子结构分离模板产物双链，远端启动子双链解开；晚期延伸阶段上下游 FID、UPD 同时结合 RNA，模板沿下游 FID 通道行进，新生产物沿 UPD 上游通道释放。模型明确盖子、PE 引发环随 RNA 长度发生大幅度位移，解释近缘病毒不具备的超长 RNA 合成能力来源，同时指出 RdRP 基序 A 构象切换是核苷类似物实现链终止的结构基础，为后续优化抑制剂分子提供改造位点参考。

Figure 5、CCHFV RNA复制循环工作模型。a EC14 结构 RNA 通路全局图，标记盖子关键分离残基 R3183。b 空载与延伸复合物盖子结构位移对比。c 蛋白横截面表面电势，标注内切酶催化天冬氨酸 D693、帽结合关键残基 F3344。d 复制四阶段分步模型：I 起始、II 起始 - 延伸转换、III 早期延伸、IV 晚期延伸。绿色=模板 RNA，青色=新生产物 RNA。