水凝胶内部微环境对组织再生与细胞定植至关重要，但这也是可注射水凝胶生物材料研发面临的一大核心难题。透明质酸（HA）在注射型生物治疗领域备受关注，然而传统透明质酸材料存在两大缺陷：缺乏仿生细胞外基质（ECM）结构，且力学性能与可注射性难以兼顾。
鉴于此，武汉纺织大学尤仁传、李秀芳、冯艳飞团队等人将携带RGD三肽序列的蚕丝纳米纤维与酪胺改性透明质酸（HA-Tyr）复合，制备出可原位成型、仿生细胞外基质的可注射水凝胶，该体系可同时模拟天然ECM中的结构蛋白与糖胺聚糖组分。水凝胶前驱液具备优异的可注射性，注射后可快速原位交联成型，能够精准贴合各类不规则组织缺损。相关研究成果以“Silk nanoengineering for in situ forming injectable ECM-inspired hydrogels”为题近期发表于《Acta Biomaterialia》上。
1.主要内容：
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的设计】
研究设计了一种HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶，旨在解决传统透明质酸水凝胶在机械强度、降解速率和生物活性之间的固有矛盾。该体系利用HRP/H2O2酶促交联实现快速原位凝胶化，通过三种共价交联（HA-纳米蚕丝、HA-HA、纳米蚕丝-纳米蚕丝）增强界面结合力和结构稳定性（图1）。选用含天然RGD序列的柞蚕纳米蚕丝作为增强相，既提供了纳米纤维骨架以模拟天然ECM结构，又赋予材料促细胞粘附的生物活性。该水凝胶可与ADSCs预混后微创注射，在靶位点快速凝胶化，精确填充不规则缺损，为干细胞递送和组织再生提供仿生微环境，具有广阔的临床应用前景。
图1 可注射HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶设计示意图
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的制备和交联机理】
研究成功合成了HA-Tyr偶联物并通过FTIR、NMR和UV-vis等表征手段证实了酪胺的成功接枝（图2a-c）。系统优化了HRP和HA-Tyr浓度对水凝胶凝胶化行为和性能的影响（图2d-f）：HRP浓度2.5 U/mL提供了45–230秒的最佳凝胶化窗口，兼顾了操作便利性和细胞存活率；随着HA-Tyr浓度升高，水凝胶的机械强度（压缩强度、杨氏模量）显著提升，弹性恢复率保持在98%以上，溶胀比最高达133.1%。0.5 wt%组因交联密度不足而快速解体。综合机械性能和水合能力，最终选定1.5 wt% HA-Tyr作为后续构建纳米蚕丝增强可注射水凝胶的最佳基质配方。
图2 HA-Tyr及其水凝胶的合成表征
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的制备与性能表征】
研究系统表征了HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶的形貌、分散性和界面化学。柞蚕纳米蚕丝（直径50–250 nm，平均146 nm）通过温和全水相工艺提取，保留了天然RGD序列和生物活性（图3a、b）。不同比例（1:0.3至1:3）的复合水凝胶凝胶化时间（47–67秒）与纯HA-Tyr相近，但纳米蚕丝含量过高（1:3）会导致自支撑能力丧失（图3c、d）。FITC荧光标记和SEM证实纳米蚕丝在HA基质中三维均匀分散，无聚集，形成连续纳米纤维骨架（图3e、f）。水接触角实验提供了关键证据：交联后纳米蚕丝的亲水性显著增加，证实HA-Tyr与纳米蚕丝之间形成了酪氨酸-酪胺共价键，建立了HA-HA、纳米蚕丝-纳米蚕丝及HA-纳米蚕丝的多重交联网络，为复合水凝胶的机械增强奠定了结构基础。
图3 不同配比HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的微观形貌
接下来，研究系统评估了纳米蚕丝含量对HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶性能的影响。随着纳米蚕丝含量增加，水凝胶溶胀比显著降低（1:2组降至80.7%），机械性能（压缩强度、杨氏模量、储能模量G′）显著提升并在1:2重量比时达到最优，但过量（1:3）会导致性能下降（图4a-d）。纳米蚕丝通过建立渗流网络、共价界面交联和物理缠结三重机制实现增强效应，同时保持超过96%的高弹性恢复率和50次循环无滞后的优异疲劳性能（图4e-g）。复合水凝胶的压缩模量（0.5–10.3 kPa）与脑、肌肉、肝脏等软组织匹配，适合软组织修复。注射力随纳米蚕丝含量增加而上升（最高1.51 N），但均低于2.00 N，满足微创递送要求；1:1组的组织粘附强度达825.17 Pa（图4h、i）。前体溶液可快速原位凝胶化，精确填充不规则缺损（图4j），展现出良好的临床应用潜力。
图4 HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶综合性能表征
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的生物降解性和生物相容性】
降解实验显示，纳米蚕丝的加入显著增强了水凝胶的抗透明质酸酶降解能力（图5a-c）：纯HA-Tyr 21天降解约80%，而1:1组仅约25%，这归因于纳米蚕丝的β-折叠晶体结构抗酶水解特性以及多重交联网络对酶渗透的物理阻碍。生物相容性研究表明（图5d-g），1:1重量比的复合水凝胶为ADSCs提供了最佳3D培养微环境：细胞代谢活性最高、增殖持续、形态从球形转变为伸长态，而过高纳米蚕丝含量（1:2）会因空间限制抑制增殖。纳米蚕丝通过RGD序列介导的整合素粘附、纳米纤维拓扑引导以及机械信号传递，协同创造了细胞指导性的仿生微环境。CM-Dil追踪证实细胞均匀分布且密度持续增加。该复合水凝胶兼具可调控的降解速率、优异细胞相容性和可注射性，是微创细胞再生治疗的理想候选材料。
图5 HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的降解行为与生物相容性
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的组织相容性】
通过皮下植入实验评估了HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶的体内组织相容性（图6）。结果显示，水凝胶植入物在体内保持稳定形态，第7天时出现轻微炎症反应和有限的炎症细胞浸润，但HA-Tyr/纳米蚕丝组界面处已有梭形成纤维细胞出现；到第14天炎症显著消退，成纤维细胞浸润增强，胶原沉积丰富且有序，表明纳米蚕丝促进了组织长入和构建性重塑。免疫组化定量分析证实，虽然初期（第7天）两组均有一定炎症反应，但HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶的IL-6和TNF-α表达水平已略低于纯HA-Tyr组；至第14天，复合水凝胶的炎症标志物阳性率显著低于纯HA-Tyr组，表明纳米蚕丝的加入不仅加速了胶原沉积和组织整合，还能更快下调炎症反应。该复合水凝胶虽然引发短暂炎症，但后期炎症消退迅速，具有良好的组织相容性，是软组织缺损修复的安全有效生物材料平台。
图6 HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的组织相容性
【HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的体内降解与干细胞递送性能】
最后，研究评估了HA-Tyr/纳米蚕丝复合水凝胶的体内降解行为和干细胞递送性能（图7）。前体溶液可在56秒内快速原位凝胶化，形成稳定的贴合植入物。14天体内实验显示，纯HA-Tyr水凝胶塌陷严重且重量损失达60%，而1:1重量比的复合水凝胶仅损失39%，结构完整性保持良好，证明纳米蚕丝有效延缓了体内降解。更重要的是，复合水凝胶支持ADSCs在体内存活14天，细胞密度随时间显著增加且明显高于纯HA-Tyr组，表明其建立了促进干细胞存活的微环境。该水凝胶兼具优异的可注射性（注射力<2N）和广泛可调的机械性能（压缩强度1.7–16.4 kPa，压缩模量0.5–10.3 kPa），通过调节纳米蚕丝含量和HA-Tyr浓度可匹配不同软组织的机械需求。尽管该体系在组织相容性和干细胞递送方面表现优异，但仍需进一步研究其组织再生功效、对干细胞干性维持和分化诱导的影响，以及RGD序列与细胞相互作用的具体机制。
图7 HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶的体内降解与干细胞递送性能
2. 全文总结：
综上所述，本研究借助蚕丝纳米工程策略制备了一款可注射仿生水凝胶，该材料能够复刻天然ECM核心结构与功能特征。本方案通过酶促多重共价交联体系，巧妙将柔性HA基质与自带 RGD 活性序列的蚕丝纳米纤维复合。水凝胶前驱液挤出力低于2N，具备优异可注射性；而内部贯穿的蚕丝纳米纤维网络可同步提升水凝胶的结构稳定性、静态与动态力学性能，同时增强其在体外、体内环境下的抗酶降解能力。除力学性能优势外，蚕丝纳米纤维可显著促进包埋脂肪间充质干细胞的体外增殖，并延长细胞存活时间；动物体内实验证实，干细胞可在该水凝胶载体中稳定存活14天。皮下植入实验结果表明，HA-Tyr/蚕丝纳米复合水凝胶拥有良好组织相容性，为软组织修复与再生领域的高端微创治疗提供一种极具前景且高效的全新技术方案。
参考资料：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706126004034?via%3Dihub
来源：EngineeringForLife
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