非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪烈性传染病，家猪、野猪感染后死亡率接近100%，被世界动物卫生组织定为报告传染病。非洲猪瘟病毒至今已传播至世界各地，致使全球养猪业造成严重的经济损失，持续多年影响大。
ASFV 感染猪后会使猪体内产生大量促炎性细胞因子，引起“细胞因子风暴”，从而损伤血管、引起多器官功能障碍甚至死亡。这种病理生理现象认知已久，但 ASFV 携带编码着哪些成分会直接导致这一强烈的反应之前是不清楚的。最近武汉大学舒红兵院士、兰州兽医研究所吴欣研究员、郑海学研究员共同在Protein Cell 一文报道了ASFV 编码 MGF_110-3L 和 MGF_110-4L 两种分泌蛋白，它们在病毒感染时从病毒中分泌出来，激活了宿主单核／巨噬细胞表面的 TLR2 信号级联，直接表现的是炎症反应。
研究背景
病毒感染宿主后，其核酸或蛋白质可被模式识别受体识别，启动天然免疫反应。ASFV的研究中以前的工作多涉及ASFV核酸被cGAS-STING或TLR9等胞内受体识别引起的下游信号传导，而ASFV是否存在分泌型蛋白主动控制免疫反应还未开展相关工作。
TLR2是单核细胞和巨噬细胞表面重要受体，可以与TLR1或TLR6形成二聚体，识别病原微生物致病分子的配体。CD14是辅助受体，可结合配体递呈给TLR2复合体，提高受体的敏感性。许多病毒，包括呼吸道合胞病毒、麻疹病毒和SARS-CoV-2，其分泌蛋白或结构蛋白可激活TLR2来引起炎症，ASFV编码吗？是否通过此类蛋白以该途径发挥作用？此前尚无报道。
两种分泌蛋白的鉴定与基本特性
研究人员采用SignalP 6.0对ASFV全部开放阅读框进行蛋白信号肽识别分析，首先在160多个蛋白中筛选出16个含在N端疏水信号序列的候选分泌蛋白，然后将这些候选基因分别表达到HEK293T细胞中，利用表达上清中的Flag来筛选候选蛋白分泌蛋白，最终鉴定出MGF_110-3L、MGF_110-4L、MGF_110-7L、MGF_110-8L和EP402R是明确的分泌蛋白。其中MGF_110-3L和MGF_110-4L分泌量最多，而且两者氨基酸序列的相似度高达92.74%，为后续的研究对象。
进一步实验表明，这2种蛋白的分泌均严格依赖于N端信号肽：信号肽缺失后，蛋白全部滞留在细胞内，在上清中无蛋白检测到；分别使用高尔基体运输抑制剂布雷菲德菌素A处理，在细胞中细胞外途径下的分泌均被完全抑制，表明这2种蛋白均是通过经典内质网-高尔基体途径运输到细胞外的。ASFV感染猪肺泡巨噬细胞后，MGF_110-3L和MGF_110-4L mRNA从感染后3小时就可检测到，蛋白在培养上清中于感染后6小时出现，证明2种蛋白属于ASFV的早期基因表达产物，感染早期即到达胞外。
单核细胞是主要靶细胞，炎症信号依赖MyD88
单细胞测序结果显示，在B细胞、T细胞和单核细胞等六类免疫群体中，单核细胞对MGF_110-3L的转录反应最为强烈，上调基因主要富集在炎症反应和NF-κB信号通路上，IL1A、IL1B、CCL3L1等促炎基因表达显著升高。MGF_110-4L处理猪树突状细胞后，TNFA、IL1B和IL6同样显著上调，KEGG分析指向Toll样受体和NF-κB通路。
在机制层面，两种蛋白能够以剂量依赖方式结合猪肺泡巨噬细胞，并诱导p65和IκBα磷酸化增强，表明NF-κB通路被激活。使用MyD88特异性抑制剂或敲除MyD88基因后，两种蛋白诱导炎症因子转录的能力被大幅削弱，回补MyD88后功能恢复，证实该信号严格依赖于MyD88这一关键接头分子。
TLR2/CD14复合物介导两种蛋白的免疫识别
为确定具体由哪类TLR介导该信号，研究者构建了TLR1至TLR9的单基因敲除细胞系。结果显示，仅TLR2敲除可最显著抑制MGF_110-3L诱导的炎症基因转录，TLR1或TLR6敲除仅有中等程度抑制。在TLR1/2或TLR2/6双敲除细胞中，NF-κB通路活化被大幅削弱。共免疫沉淀实验证实两种蛋白均可与TLR1、TLR2和TLR6结合，并能促进TLR2与TLR1或TLR6的异源二聚化。微量热泳动实验测得两种蛋白与TLR2胞外域的结合亲和力分别为0.53 μmol/L和0.45 μmol/L。在猪原代细胞中使用TLR2特异性抑制剂，同样显著抑制了两种蛋白诱导的炎症因子转录。
研究进一步探讨了CD14的作用。在CD14基因敲除细胞中，MGF蛋白诱导的炎症因子转录和NF-κB磷酸化水平均显著下降。共免疫沉淀和微量热泳动实验证实两种蛋白可直接结合膜型CD14，亲和力分别为0.123 μmol/L和0.14 μmol/L。当三者共表达时，CD14的存在显著增强了TLR2与MGF蛋白之间的相互作用，说明CD14作为辅助受体，可促进MGF蛋白与TLR2的结合并放大信号输出。
基因缺失株使病毒完全减毒，炎症反应大幅降低
小鼠实验证实，Tlr2基因敲除后，MGF_110-3L或MGF_110-4L诱导骨髓来源巨噬细胞表达Il1b和Il6的能力显著下降。将重组MGF_110-3L蛋白静脉注射后，Tlr2缺失小鼠血清中IL-1β和TNFα水平显著低于野生型，肺组织炎症细胞浸润和肺泡间隔增厚等病理改变也明显减轻。
研究者进一步构建了MGF_110-3L单基因缺失（ASFV-Δ3L）和MGF_110-4L单基因缺失（ASFV-Δ4L）的重组ASFV毒株。两种缺失株在细胞中的复制能力与野生型无显著差异。以3 HAD50剂量接种健康猪后，野生型感染组7天内全部死亡，而两个缺失株感染组全部存活至21天。缺失株感染猪体温正常、病毒载量低，血清中IL-1β、TNFα和IL-6水平显著低于野生型，心脏、肝脏、脾脏、肺脏等器官的出血和炎症病变也大幅减轻。
总结
总之，这项研究系统鉴定了ASFV编码的两种分泌蛋白MGF_110-3L和MGF_110-4L，阐明了它们通过结合宿主单核/巨噬细胞表面的TLR2/CD14复合物、激活MyD88依赖的NF-κB信号通路来驱动系统性炎症反应的完整分子机制。基因缺失动物实验证实，单独缺失其中任一基因即可大幅降低病毒毒力，被感染猪没有表现临床症状且全部存活。这些发现将MGF_110-3L和MGF_110-4L明确定位为ASFV的关键毒力因子，为基于双基因联合缺失的减毒活疫苗策略提供了理论依据和候选株，也为靶向TLR2/CD14信号轴的抗ASFV药物开发指明了新方向。
来源：Yue Wang, et al. African swine fever virus MGF_110-3L and MGF_110-4L signal TLR2-mediated lethal inflammation, Protein & Cell, 2026;, pwag047, https://doi.org/10.1093/procel/pwag047
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