武汉大学邓鹤翔教授、田沺教授、余锂镭教授和上海科技大学江怀东教授通过网状合成策略构建系列结构可调 Cu 基 MOF 库，筛选出氨基修饰 MOF-248-NH₂，其孔道限域 Cu (I) 簇可无外源还原剂高效催化 RNA 脱保护 / 点击反应，在细胞层面实现 CRISPR 基因编辑的可逆调控，并首次在犬类心脏病大动物模型完成靶向基因治疗验证。相关工作发表在JACS。
精准生物过程调控是疾病治疗核心方向，天然酶具备分子识别与催化双重优势，但稳定性差、成本高；人工生物正交催化剂可替代酶实现活体可控化学反应，而传统均相铜催化剂存在金属毒性、需外加还原剂、难以精准识别底物等缺陷。MOF 拥有原子级规整孔道与有序金属活性位点，具备分子识别潜力，但此前仅用于体外 RNA 转化，未在活细胞、活体器官中验证生物正交催化功能。现存两大瓶颈：一是缺乏可系统调控孔尺寸、金属簇构型、孔化学环境的 MOF 平台；二是催化体系依赖抗坏血酸等外源还原剂，难以适配生理环境。本研究搭建多构型 Cu-MOF 筛选库，攻克上述难题，拓展多孔晶体在活体基因治疗领域应用。
采用溶剂热法合成 14 种不同 Cu 簇、孔径、官能团的 Cu 基 MOF 单晶与纳米颗粒，依托同步 / 实验室 XRD、SCXRD、SEM、XPS、AES、N₂吸附完成结构与孔道表征；体外以聚丙烯酰胺凝胶电泳评价 MOF 催化 RNA 脱保护活性，SAXS 解析 RNA 在孔内空间排布；细胞层面采用 T7E1 实验定量 CRISPR 编辑效率，同步软 X 射线断层扫描、共聚焦显微镜观测 MOF 胞内定位与晶格完整性，克隆形成实验评估细胞相容性；活体构建犬急性心律失常模型，局部递送 MOF 调控星状神经节 sgRNA 活性，结合电生理、免疫荧光、血液生化评价基因治疗效果，配套多组统计学分析验证数据可靠性。
图1. 铜基金属有机框架（Cu-MOFs）孔道的网状设计用于生物正交化学。 我们构建了含有多种Cu簇、单核Cu配合物、平面正方形Cu(INA)₄和四面体t-Cu(INA)₄二核Cu簇、Li₂I₂(INA)₄和三溴CuBr₂(INA)₄三核Cu簇、μ₃-氧桥连(μ-pyCA)₃三核Cu₄簇、Cu₃L₄(INA)₄和CuBr₄(INA)₄四核Cu簇的MOF结构，这些结构具有不同的孔径大小和拓扑学特征。图中Cu、Li、Br、C、N和O原子分别用金色、深蓝色、深绿色、灰色、浅蓝色和红色标记。Zr₆O₈构筑单元用浅灰色多面体标记。Cu簇的几何构型在示意图中进行了展示。
示意图1. MOFs的网状精确性使其能够在多个生物学尺度上实现生物正交化学； (A) MOFs的分子可调性和结晶性能够实现精确且可编程的生物正交反应；其化学功能可以被精确地定制到其孔道环境中，从而为生物底物创造定制化的反应环境，而Cu(I)催化位点（标记为橙色）则被锚定并稳定在晶格中；这些特性赋予了MOFs优异的催化选择性和效率，建立了一个用于生物正交化学的网状设计平台；(B) 利用分子定义的MOFs对多种DMProt RNA保护基团进行选择性、定量去除，从而将受保护的RNA分子（红色）转化为原始形态（绿色），以恢复其生物活性；(C) MOFs触发的基因编辑示意图，用于在犬类模型中实现心律失常的按需治疗；通过MOF孔道实现顺序RNA转化，从而激活CRISPR/Cas9进行基因编辑：LSG（左星状神经节）组织中Nav1.8蛋白的表达下调，从而抑制LSG过度活跃并预防心源性猝死。
图2. MOFs作为体外RNA键断裂反应的生物正交催化剂。 (A) 进行了初步的体外反应以确定最佳的MOF。 (B) 九种原始Cu-MOFs和对照化合物（Cu(II) + BTTAA、Cu₂O、Cu₃I₂(Py)₃和Cu₄I₄(Py)₄）在将DMProt-RNA-21 nt转化为原始RNA-21 nt时的催化性能。插图显示了MOF-248-NH₂的催化性能。(C) 不同MOF-248衍生物中DMProt-RNA（32 nt）的反应效果。将MOF-248-NH₂、-Cl⁻、-OCH₃-F和-NO₂的催化性能与作为参考的母体结构（MOF-248）进行比较，突出了DMProt-RNA完全转化效率的提升。数据为平均值±标准差，n = 3。(D) 比较了MOFs和均相Cu系统将DMProt-RNA-32 nt完全转化所需的Cu浓度。将这些反应的Cu浓度与均相系统所需的浓度进行基准对比，并列出了相应的残留金属足迹。(E) 在32 μM Cu浓度下测试了MOF-248-NH₂和代表性非MOF催化剂催化的DMProt-RNA裂解反应，在64 μM Cu浓度下测试了Cu₂O纳米颗粒、Cu₃I₂(Py)₄和Cu₄I₄(Py)₄。MOF-248-NH₂显示出比Cu₂O纳米颗粒和分子Cu配合物更高的活性，并达到了与均相Cu催化剂相当的反应动力学特征，且无需外源配体和还原剂。数据表示为平均值±标准差，n = 3。
图3. MOF孔道环境影响X射线衍射揭示的DNA空间分布。 通过对应SAXS（小角X射线散射）曲线的差分傅里叶分析，构建了3D电子密度图，以揭示MOFs中不同孔道环境对DNA空间分布的影响。电子密度图沿[001]方向呈现，并用虚线标出，可视化了RNA在MOF晶格中的空间排列。放大Cu₃I₄(INA)₄簇周围的区域揭示了不同的电子密度模式，反映了DNA与催化中心的不同空间邻近度。越靠近Cu₃I₄催化位点，催化性能越高。
图4. MOFs作为细胞内RNA转化的生物正交催化剂。 (A) MOF-248-NH₂在HeLa细胞中激活sgRNA键断裂反应的示意图，即DMProt保护基从DNA中被切除分成两个片段；(B) T7E1分析对HeLa-OC细胞中恢复的CRISPR/Cas9基因编辑活性的定量分析，显示仅在存在MOF-248-NH₂时具有活性，而在Cu(II) + BTTAA且无催化剂的组中未检测到活性。数据为平均值±标准差，n = 3；应用Welch校正t检验进行统计分析（ns，不显著；P < 0.0001）。(C) 不同MOF-248-NH₂的Cu浓度下CRISPR/Cas9基因编辑活性的恢复情况，其中需要30 μM的最低Cu浓度才能实现理想的活性恢复。数据为平均值±标准差，n = 3。(D) MOF-248-NH₂在HeLa-OC细胞中催化Biotin-N₃-分子和Proc-sg-SLX4IP形成键断裂反应，导致CRISPR/Cas9基因编辑活性失活，其中目标DNA保持完整；活性使用T7E1分析定量。数据为平均值±标准差，n = 3；应用Welch校正t检验进行统计分析（ns，不显著；P < 0.001；P < 0.0001）。(E) CRISPR/Cas9基因编辑活性在HeLa-OC细胞的对照组中得以维持（Cu(II) + BTTAA且无催化剂）。数据为平均值±标准差，n = 3；应用Welch校正t检验进行统计分析（ns，不显著；P < 0.01，P < 0.001）。(F) 不同MOF-248-NH₂的Cu浓度下CRISPR/Cas9基因编辑活性的抑制作用，其中最低8 μM的Cu浓度即能够实现理想的活性抑制。数据为平均值±标准差，n = 3。(G) 通过7天克隆形成实验评估MOF-248-NH₂在HeLa-OC细胞中的细胞相容性。显示了在测试的Cu浓度下处理细胞后的代表性克隆形成图像和克隆数量的定量。(H) 评估MCF-7细胞在测试的Cu浓度下经H₂O₂、DMSO、MOF-248-NH₂或Cu(II) + BTTAA + NaAsc处理后的细胞相容性。显示了代表性克隆形成图像和克隆数量的定量。数据表示为平均值±标准差，n = 6；应用Welch校正t检验进行统计分析（ns，不显著；**P < 0.0001）。
图5. 利用X射线断层扫描和共聚焦成像对人类细胞内MOF-248-NH₂纳米颗粒分布的可视化。 (A) 对整个细胞内MOF分布进行成像的软X射线断层扫描装置示意图。(B) 含有MOF纳米颗粒的HeLa-OC细胞的光学图像，比例尺10 μm。(C) MOF包含细胞的顶部和侧面视图光学图像，以及沿Z轴在不同图像深度重建RNA结构的示意图。(D) HeLa-OC细胞的软X射线光片显微镜图像，其中在细胞内部清晰解析出MOF纳米颗粒，并在侧向分辨率10.9 nm下突出显示。(E) 基于20个深度为20 nm切片的多层光片显微图像对HeLa-OC细胞内MOF纳米颗粒的多层重建，突出了内部纳米颗粒的相位对比。比例尺500 nm。(F) (E)中所示区域的顶部视图。相位以两种颜色形式绘制，彩色和黑白。同一区域以彩色沿图像深度绘制的侧视图。(G) MOF处理后多个HeLa-OC细胞的共聚焦图像，其中暗场图像在353和550 nm波长下激发并与明场图像合并。MOF纳米颗粒和细胞核分别用红色和蓝色荧光标记。(H) 基于单个细胞内24个深度为19.1 nm的切片对HeLa-OC细胞内MOF纳米颗粒和细胞核的光学共聚焦图像的多层重建。(I) 基于两侧和顶部视图的光学共聚焦图像对HeLa-OC细胞内MOF纳米颗粒的3D重建，侧向分辨率为47 nm。
图6. MOFs作为犬类心脏病模型中体内RNA激活的生物正交催化剂。 (A) 在犬类心脏病模型中激活由sg-SCN10A触发的CRISPR/Cas9基因编辑，其中MOF-248-NH₂用于去除sg-SCN10A的保护基，导致CRISPR/Cas9基因编辑触发Nav1.8蛋白在LSG组织中的下调，从而抑制LSG过度活跃，进而预防心源性猝死。体内工作流程显示在流程图中。数据为平均值±标准差，n = 6；应用Welch校正t检验进行统计分析（ns，不显著；P < 0.0001）。(B) 通过MOF-248-NH₂恢复Cas9活性，其中LSG组织中的基因编辑恢复了80%的活性，使用盐和DMProt-sg-SCN10A作为对照。数据为平均值±标准差，n = 6；单向方差分析（one-way ANOVA）和Tukey's诚实显著差异（HSD）检验应用于(C,D)的统计数据分析（ns，不显著；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.0001）。(C) 通过MOF干预减少神经元放电频率和幅度，以及在犬中增加VF（室颤）阈值，表明抑制了心源性猝死。NSVT：非持续性室速；VA：室性心律失常；VF：心室颤动。(D) 数据表示为平均值±标准差，n = 3，单向方差分析和Tukey's HSD检验应用于统计数据分析（ns，不显著；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，**P < 0.0001）。
材料设计创新：首次系统构建含 14 种铜簇、孔径、官能团可变 Cu-MOF 筛选平台，筛选得到 MOF-248-NH₂，晶格固定 Cu (I) 无需外源还原剂，解决传统催化体系还原剂依赖、金属泄漏问题。
全新限域催化机制：氨基修饰孔道实现底物空间选择性，优先结合保护 RNA、解离脱保护产物，从分子层面解释高效定量转化的根源。
多层次生物学验证：体外可催化不同长度 RNA；活细胞实现 CRISPR 可逆激活 / 抑制，降低脱靶效应；全球首次将 MOF 生物正交催化应用于犬大动物心脏疾病模型，实现安全有效的基因干预。
领域拓展价值：突破 MOF 仅作为药物载体的固有认知，证明网状孔道工程是设计可编程活体生物正交催化剂普适策略，为基因精准治疗提供全新多孔材料路线。
📜 文章链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.6c03260
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