武汉同济医院 | ISG15 调控肝星状细胞活化,靶向 CREB1 可逆转肝纤维化

肝纤维化是各类肝损伤修复的关键阶段，可进展为肝硬化甚至肝衰竭，病死率高，目前缺乏获批的靶向治疗药物，肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的核心环节，HSC 由静息态转为肌成纤维细胞，大量分泌胞外基质是纤维化进展的核心病理基础。ISG15 是 I 型干扰素下游关键分子，主要通过 ISGylation 翻译后修饰调控蛋白功能，参与抗病毒免疫、肿瘤进展、心脏及肾脏纤维化等多种病理过程。已有研究证实 ISGylation 可调控肝细胞及 HSC 中 p53、β- 连环蛋白等分子，乙肝、丙肝病毒感染也与 ISG15 表达相关，但 ISG15 及其 ISGylation 修饰在肝星状细胞活化和肝纤维化发生发展中的具体作用、分子机制尚未明确。同时 TGFβ2/SMAD2 是驱动 HSC 活化的经典通路，CREB1 作为重要转录因子可调控 TGFβ2 转录，二者是否受 ISG15 调控仍待阐明，也亟需挖掘肝纤维化全新分子靶点与治疗策略。

临床层面收集肝硬化与非肝硬化患者肝组织样本，进行 qPCR、免疫组化、免疫荧光检测 ISG15、IRF9 与纤维化标志物表达及相关性分析；生物信息学分析单细胞测序及芯片数据，筛选 ISG15 在正常与纤维化肝脏 HSC 中的表达差异。动物层面构建 HSC 特异性 ISG15 敲除（ISG15cKO）小鼠，设置野生型对照，建立 CCl₄、BDL、CDAHFD 饮食诱导的实验性肝纤维化模型及 18 月龄老龄自发纤维化模型，检测血清肝酶、肝组织羟脯氨酸，经 H&E、天狼星红、马松染色及免疫染色评估纤维化与炎症水平。体外分离原代 HSC、采用 LX-2 细胞系，通过 CRISPR 敲除、shRNA/siRNA 敲低调控 ISG15、UBE2L6、USP18 表达；运用蛋白质组学、免疫共沉淀、质谱、SPR、分子对接、ChIP、双荧光素酶报告基因实验解析蛋白互作与转录调控；体内采用 AAV 靶向过表达 ISG15、CREB1 抑制剂 666–15 及 TGFβ2 中和抗体进行干预验证。

ISG15 在纤维化肝组织及活化 HSC 中显著低表达，与患者肝组织 α-SMA 表达呈负相关，肝硬化患者活化 HSC 中 ISG15、IRF9 阳性细胞比例大幅下降；IRF9 可介导 IFN-β 调控 ISG15 转录。HSC 特异性 ISG15 敲除小鼠 18 月龄可自发肝纤维化，在 CCl₄、BDL、MASH 模型中肝损伤、胶原沉积、炎症及 HSC 活化程度显著加重。体外 ISG15 缺失或 ISGylation 降低促进 HSC 活化、增殖及胞外基质分泌，增强则抑制纤维化表型；蛋白质组学筛选发现 ISG15 缺失显著上调 TGFβ2，激活 TGFβ2/SMAD2 通路。机制上 ISG15 直接结合并 ISGylation 修饰 CREB1 的 Lys304/305 位点，抑制 CREB1 磷酸化、核转位及与 TGFβ2 启动子结合，减少 TGFβ2 转录。HSC 靶向过表达 ISG15、TGFβ2 中和抗体或 CREB1 抑制剂 666–15 均可显著减轻小鼠肝纤维化、肝损伤及炎症反应。

图 1 肝纤维化活化肝星状细胞中 ISG15 呈低表达且与纤维化标志物负相关

该图依托单细胞测序、动物实验、细胞体外培养及临床肝组织样本多维度验证，明确 ISG15 在肝纤维化进程中的表达特征与相关性。首先通过正常及肝纤维化小鼠肝脏单细胞测序分群分析，发现 ISG15 主要富集于正常肝脏成纤维细胞 / 肝星状细胞亚群，在纤维化肝组织的该细胞亚群中表达显著下调；四氯化碳、胆管结扎诱导的纤维化小鼠原代肝星状细胞及肝组织中，ISG15 蛋白和 ISGylation 修饰水平均明显降低；体外静息肝星状细胞自发活化培养过程中，随培养时间增加 α-SMA 纤维化标志物表达上升，ISG15 表达持续下降，与公共芯片数据趋势一致；临床肝硬化患者肝组织中 ISG15 mRNA 表达与 α-SMA 呈显著负相关，免疫荧光染色进一步证实肝硬化患者肝组织中 Desmin 标记的肝星状细胞内 ISG15 阳性细胞比例远低于非肝硬化人群，整体证实 ISG15 在活化肝星状细胞中特异性低表达，且与肝纤维化程度负向关联。

图 2 肝星状细胞特异性敲除 ISG15 可诱导小鼠自发性肝纤维化

该图利用 Lrat-Cre 构建肝星状细胞特异性 ISG15 敲除（ISG15cKO）小鼠模型，探究生理衰老状态下 ISG15 缺失对肝脏的影响。通过基因鉴定成功构建敲除小鼠并验证原代肝星状细胞中 ISG15 敲除效率；9 月龄 ISG15cKO 小鼠肝功能 ALT、AST 无明显异常，但肝脏羟脯氨酸含量轻微升高，已出现早期纤维化趋势；18 月龄敲除小鼠肝脏表面形态不规则，肝组织羟脯氨酸含量显著升高，而肝损伤转氨酶仍无明显差异，提示纤维化发生早于明显肝细胞损伤；蛋白及基因检测显示 18 月龄敲除小鼠肝组织中 α-SMA、Col1α1 等纤维化标志物及炎症相关基因表达大幅上调；肝组织 H&E、天狼星红、马松染色及免疫组化、Ishak 评分结果表明，随月龄增长 ISG15cKO 小鼠逐渐出现胶原大量沉积、肝星状细胞持续活化及炎症浸润，最终证实肝星状细胞中 ISG15 缺失可随年龄增长诱发小鼠自发性肝纤维化。

图 3 肝星状细胞 ISG15 缺失显著加重实验性诱导肝纤维化

该图在四氯化碳（CCl4）、胆管结扎（BDL）两种经典肝纤维化小鼠模型中，验证肝星状细胞特异性 ISG15 敲除对病理性肝纤维化进展的调控作用。CCl4 干预 8 周后，ISG15cKO 小鼠血清 ALT、AST 及肝组织羟脯氨酸含量较野生型显著升高，肝组织病理染色显示胶原沉积、纤维间隔形成及炎症浸润程度大幅加剧，纤维化与促炎标志物的蛋白和 mRNA 表达均显著上调；BDL 术后 3 周敲除小鼠同样呈现肝损伤指标升高、胶原沉积增多、肝星状细胞过度活化及炎症基因高表达；结合代谢相关脂肪性肝炎饮食模型的补充结果，共同证明无论化学损伤、胆道梗阻还是代谢诱导的肝纤维化模型中，肝星状细胞 ISG15 缺失都会显著加剧肝组织损伤、胶原沉积、肝星状细胞活化及炎症反应，加速实验性肝纤维化进展。

图 4 ISG15 缺失通过激活 TGFβ2/SMAD2 信号通路促进肝星状细胞活化

该图通过蛋白组学、分子生物学及细胞功能实验解析 ISG15 调控肝星状细胞的下游信号通路。对野生型和 ISG15 敲除 LX-2 肝星状细胞进行蛋白组学分析，主成分分析显示两组蛋白表达谱明显分离，筛选出大量差异表达蛋白，KEGG 富集分析提示细胞黏附、细胞因子受体互作等炎症纤维化通路显著富集；在差异炎症相关蛋白中锁定 TGFβ2 为 ISG15 缺失后上调最显著的蛋白之一，WB 和 ELISA 验证 ISG15 敲除、ISGylation 修饰抑制可上调 TGFβ2 蛋白表达与分泌，增强 ISGylation 则反之；同时 ISG15 缺失不影响 TGFβ1、TGFβ3 表达，仅特异性调控 TGFβ2，并下游激活 SMAD2 磷酸化；在 LX-2 和人原代肝星状细胞中敲低 TGFβ2 后，可逆转 ISG15 缺失诱导的细胞增殖、α-SMA 和 Col1α1 纤维化标志物上调，明确 ISG15 缺失依赖 TGFβ2/SMAD2 通路介导肝星状细胞活化、增殖及胞外基质合成。

图 5 ISG15/ISGylation 通过抑制 CREB1 转录活性负向调控 TGFβ2 转录

该图深入阐释 ISG15 调控 TGFβ2 转录的分子机制，聚焦转录因子 CREB1 的功能调控。qRT-PCR 和双荧光素酶实验证实，ISG15 缺失或 ISGylation 抑制可显著升高 TGFβ2 的 mRNA 水平和启动子转录活性，增强 ISGylation 则抑制其转录；ISG15 敲除不改变 CREB1、SP1、RFX1 总蛋白表达，但显著提升 CREB1 磷酸化水平并促进 CREB1 核转位；染色质免疫沉淀实验显示 ISG15 缺失会增强 CREB1 与 TGFβ2 启动子区域的结合能力，且 TGFβ2 启动子中 CRE-L 核心序列突变后转录活性显著下降，证实 CREB1 通过该保守序列调控 TGFβ2 转录；将 ISG15 羧基端修饰关键位点突变失活后，ISG15 过表达无法抑制 p-CREB1 水平、CREB1 核定位及 CREB1 与 TGFβ2 启动子的结合，证明 ISG15 依赖完整的 ISGylation 修饰功能，抑制 CREB1 磷酸化与核转位、减弱其结合 TGFβ2 启动子的能力，进而抑制 TGFβ2 转录。

图 6 ISG15 直接结合并 ISGylation 修饰 CREB1 的特定位点

该图通过质谱、免疫共沉淀、共聚焦、表面等离子体共振及位点突变实验，确定 ISG15 与 CREB1 的相互作用及修饰位点。质谱筛选鉴定出 CREB1 为 ISG15 的互作蛋白，外源及内源免疫共沉淀验证两者存在特异性结合，且 ISG15 羧基端功能基序突变后结合能力丧失；细胞共聚焦成像显示 ISG15 与 CREB1 在胞内存在明显共定位，表面等离子体共振证实两者可直接高亲和力结合；分子对接及质谱肽段分析提示 CREB1 的 Lys304、Lys305 为潜在 ISGylation 修饰位点，对该位点进行突变后，ISG15 无法结合并修饰 CREB1；同时该位点突变可逆转 ISG15 介导的 p-CREB1 及 TGFβ2 表达抑制，证明 ISG15 通过共价修饰 CREB1 的 Lys304 和 Lys305 位点，不改变 CREB1 总蛋白表达，而是抑制其磷酸化及转录活性，进而调控下游通路。

图 7 肝星状细胞特异性过表达 ISG15 可缓解四氯化碳诱导的肝纤维化

该图采用腺相关病毒介导肝星状细胞靶向 ISG15 过表达，在体内验证 ISG15 的抗纤维化治疗作用。构建 AAV 介导肝星状细胞特异性过表达 ISG15 的干预体系，验证病毒载体可高效靶向肝星状细胞并恢复 ISG15 表达；在 CCl4 纤维化模型中，对 ISG15cKO 敲除小鼠及野生型小鼠进行 ISG15 过表达干预，结果显示恢复 ISG15 表达可显著降低小鼠血清 ALT、AST 及肝组织羟脯氨酸含量；肝组织病理染色证实 ISG15 过表达能明显减少胶原沉积、肝星状细胞活化及炎症浸润，下调 α-SMA、Col1α1 等纤维化蛋白与炎症基因表达；同时可显著抑制 CREB1 磷酸化、TGFβ2 及 SMAD2 通路激活，野生型小鼠过表达 ISG15 也呈现轻度抗纤维化效果，证实体内恢复肝星状细胞 ISG15 表达可通过抑制 CREB1/TGFβ2/SMAD2 通路，有效减轻化学性肝损伤与纤维化。

图 8 CREB1 抑制剂 666-15 可逆转 ISG15 缺失介导的肝纤维化并总结分子机制

该图结合临床样本、药物干预及机制模式图，验证 CREB1 作为肝纤维化治疗靶点的可行性并梳理完整调控通路。临床肝硬化患者肝组织免疫组化显示 p-CREB1 在活化肝星状细胞中高表达，与肝硬化进程密切相关；采用 CREB1 特异性抑制剂 666-15 干预 ISG15cKO 小鼠 CCl4 纤维化模型，药物处理后小鼠肝损伤转氨酶、羟脯氨酸含量显著回落，肝组织胶原沉积、炎症浸润及肝星状细胞活化明显改善；纤维化标志物、炎症基因及 CREB1/TGFβ2 通路蛋白表达均被显著抑制；最后通过机制模式图系统总结：I 型 IFN 诱导 ISG15 表达，经 ISGylation 修饰 CREB1 的 Lys304/305 位点，抑制 CREB1 磷酸化与核转位，减少其结合 TGFβ2 启动子，进而下调 TGFβ2/SMAD2 通路，抑制肝星状细胞活化与肝纤维化；而 ISG15 缺失则解除该抑制效应，CREB1 过度激活驱动 TGFβ2 转录促纤维化，666-15 可靶向抑制 CREB1 活性阻断病理进程，为肝纤维化提供潜在治疗靶点。

HSC 中 ISG15 在肝纤维化进程中呈低表达，是调控 HSC 活化与肝纤维化的关键抑纤维化分子；ISG15 通过 ISGylation 修饰 CREB1 的 Lys304/305 位点，抑制 CREB1 磷酸化活性与核转位，减弱其对 TGFβ2 的转录激活作用，进而抑制 TGFβ2/SMAD2 信号通路，减少 HSC 活化、增殖及胞外基质沉积。HSC 特异性 ISG15 缺失会诱发自发性肝纤维化并加重实验性肝纤维化；靶向过表达 ISG15 或药物抑制 CREB1 活性可有效逆转肝纤维化，ISG15-CREB1-TGFβ2 轴是肝纤维化全新发病机制，可为临床抗纤维化治疗提供潜在靶点与转化方向。

老龄小鼠自发纤维化模型中，衰老伴随的代谢紊乱、免疫异常可能协同加重纤维化，存在混杂干扰；未探究肝细胞、巨噬细胞等其他细胞中 ISG15 的作用。未来可开展多组学分析、多细胞特异性敲除模型，探究 ISG15 对 TGFβ 不同亚型的调控差异，推进 666–15 的临床用药剂量与安全性研究。