顶刊重磅!武汉大学*英国阿伯丁大学:发现全新RiPP家族,解锁天然肽合成新密码

这一发现不仅填补了RiPP结构与酶学机制的空白，更为新型抗肿瘤肽药物开发提供了全新分子骨架。

一、研究背景：RiPP领域的“未竟之地”

核糖体合成后修饰肽（RiPP）是一类结构多样、活性优异的天然产物，广泛存在于微生物中，仅由20种标准氨基酸编码，却能通过翻译后修饰（PTM）形成复杂环化、非天然氨基酸等独特结构，是抗菌、抗肿瘤药物的重要来源。

但在已知RiPP中，含β-氨基酸、双硫醚大环的分子极为罕见，其合成酶与修饰机制长期未被解析。 同时，传统硫醚环（Lan、Lab、AviCys）的合成路径已相对清晰，但全新双硫醚环（MAbi）与β-烯胺酸（Aaa）的组合结构，在天然产物中从未被报道。

研究团队从加纳土壤链霉菌Streptomyces sp. RK44中，锁定一种未知分子量代谢物，开启结构解析与合成机制探索。

二、核心研究内容：从结构到合成，层层突破

1. Kintamdin结构解析：全新骨架首次亮相

研究团队通过高分辨质谱、NMR、基因组挖掘、AIMD分子动力学联合解析，确定化合物7为全新RiPP，命名Kintamdin。

关键结构亮点：

• 含前所未有的双硫醚大环MAbi（methyl-amino-bithionin）
• 含罕见**(Z)-β-烯胺酸Aaa（3-amino-acrylic acid）**
• 含D-Ala、N,N-二甲基异亮氨酸、Dha、Dhb等多种修饰残基
• 对乳腺癌、皮肤癌细胞显示强选择性细胞毒性（乳腺癌IC₅₀=0.6±0.1 μM）

2. 已知RiPP硫醚环结构对比：确立独特性

文章系统对比已知硫醚环（Lan、Lab、AviCys、Avionin）的合成机制，明确Kintamdin的MAbi环不属于任何已知RiPP类型。

• Lan/Lab：羊毛硫肽经典环，依赖Ser/Thr脱水→Cys加成
• AviCys/Avionin：依赖黄素蛋白脱羧酶与激酶同源蛋白协同
• Kintamdin MAbi：双Cys+Dhb形成双硫醚桥，合成路径完全新颖

3. 核心修饰位点与NOE远程耦合验证

通过NOE远程耦合与AIMD计算，确定MAbi环四个手性中心构型：11R、22αS、22βS、27S，是唯一匹配实验信号的立体结构。

4. 最小生物合成基因簇（BGC）鉴定：kin基因簇

基因组挖掘与异源表达、基因敲除验证，锁定15个基因组成的最小kin基因簇，其中4个核心酶负责关键后修饰：

• KinD：磷酸转移酶
• KinC：磷酸苏氨酸裂解酶
• KinH：激酶同源蛋白（无催化活性，起结合调控）
• KinI：黄素依赖半胱氨酸脱羧酶

基因敲除结果：

• ΔkinC/ΔkinD：完全丧失Kintamdin合成
• ΔkinH/ΔkinI：无法形成MAbi双硫环
• ΔkinO：积累未甲基化中间体8
• ΔkinI：积累线性肽中间体9

5. 脱水与环化两步核心反应解析

第一步：KinC+KinD组成双组分脱水酶

• KinD催化Ser/Thr磷酸化
• KinC催化磷酸消除，生成Dha/Dhb
• 独特性：从N端 processive 催化，且能将Ser-7转化为β-烯胺酸Aaa

第二步：KinH+KinI协同催化MAbi双硫环形成

• KinI催化C端Cys氧化脱羧
• KinH作为必需调控亚基，介导环化
• 最终形成双硫醚大环MAbi

6. 核心肽段定点突变：关键残基功能验证

对前体肽核心区（CP）进行定点突变，明确：

• N端4个连续Thr（Thr2/3/4/6）协同调控Aaa形成
• Ser7可突变为Thr，酶仍可催化生成甲基-Aaa
• Cys11是MAbi环形成必需位点，突变则完全无法环化

7. 完整生物合成途径模型：从线性肽到成熟分子

研究提出Kintamdin全合成路径：

1. KinCD催化连续脱水，生成Aaa与全部Dha/Dhb
2. KinHI协同催化C端Cys脱羧→双硫醚MAbi环化
3. KinJ还原Dha为D-Ala
4. KinEF切除前导肽
5. KinO催化N端二甲基化，生成成熟Kintamdin

三、实验与分析方法流程总结

本文采用天然产物化学 + 合成生物学 + 结构生物学 + 计算化学多维度整合方案：

1. 菌株发酵与化合物分离：10 L发酵→分离纯化得到Kintamdin（3 mg）
2. 结构解析：HRMS、1D/2D NMR、Marfey法、AIMD辅助NOE解析
3. 基因组挖掘：BLAST定位前体肽kinA，确定kin基因簇
4. 基因操作：TAR克隆、异源表达、基因敲除、定点突变
5. 体外共表达：大肠杆菌共表达验证酶功能（KinCD、KinHI）
6. 质谱分析：UPLC-QTOF、FT-ICR MS、MS/MS碎片解析
7. 生物信息学：SSN序列相似性网络、同源BGC挖掘

四、结论与展望

核心结论

1. 发现全新RiPP分子Kintamdin，含全球首例MAbi双硫醚大环与罕见β-烯胺酸Aaa
2. 鉴定全新双组分脱水酶KinCD与双组分环化酶KinHI，酶同源性极低，代表全新催化机制
3. 明确前体肽关键残基（N端Thr簇、Cys11、Ser7）对修饰的调控作用
4. 基因组挖掘发现两类Kintamdin类似物，证明β-bithionins是广泛存在于放线菌的全新RiPP家族

研究意义

• 拓展RiPP结构多样性，填补β-氨基酸+双硫醚环的合成机制空白
• 提供高选择性抗肿瘤肽骨架，可用于药物分子设计
• 为合成生物学改造RiPP提供全新酶工具与模块化思路

未来展望

• 解析KinCD/KinHI晶体结构，揭示Aaa与MAbi精准催化机制
• 扩大基因组挖掘，发现更多β-bithionins家族成员
• 开展半合成与生物工程，优化抗肿瘤活性与成药性

论文信息

• 题目：A ribosomally synthesised and posttranslationally modified peptide containing a β-enamino acid and a macrocyclic motif
• 期刊：Nature Communications
• DOI：10.1038/s41467-022-32774-3
• 发表时间：2022-08-26
• 发表单位：
1. 英国阿伯丁大学化学系
2. 武汉大学药学院（教育部组合生物合成与新药发现重点实验室）
3. 加纳大学化学系
4. 英国爱丁堡大学、葡萄牙科英布拉大学、英国中央兰开夏大学等