文献分享| 武汉协和与山西附一团队,构建⁶⁸Ga-LLP2A靶向VLA-4的PET分子探针实现急性心脏排斥反应无创成像

心脏移植（HT）是终末期心力衰竭患者的最佳治疗选择，全球每年新增超过5000例心脏移植，且呈逐年上升趋势。急性排斥反应（AR）是术后第一年内导致移植物失败的最重要风险因素，尽管免疫抑制治疗不断进步，AR仍居高不下。目前AR的诊断金标准——心内膜心肌活检（EMB）——为侵入性操作，伴随严重并发症风险；而常规影像学方法仅在心肌损伤已广泛发生、患者出现明显症状时才能做出诊断。因此，开发新型无创影像学手段实现AR的早期诊断极为迫切。

分子影像学在分子水平检测疾病的发生和进展，有望突破上述瓶颈。其中，PET探针能够识别AR中不同细胞群体的募集和分化，为AR诊断和治疗提供日益重要的研究工具。极迟抗原-4（VLA-4），又称整合素α4β1（Integrin α4β1）或CD49d/CD29，是整合素超家族成员，在除中性粒细胞外的所有白细胞表面表达。VLA-4通过与血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）结合介导白细胞与血管内皮细胞的黏附，在淋巴细胞分化和转运中发挥关键作用。因此，VLA-4有望成为AR诊断的潜在靶点。

本研究以NODAGA为双功能螯合剂，对高亲和力VLA-4肽拟态配体LLP2A进行结构修饰，构建放射性核素探针⁶⁸Ga-LLP2A，并首次将其应用于移植排斥领域。通过体内外靶向效率和特异性验证、大鼠腹部异位心脏移植模型PET/CT成像、离体放射自显影、生物分布及免疫荧光染色，系统评估了⁶⁸Ga-LLP2A通过追踪VLA-4受体分布实现急性心脏排斥反应无创诊断的可行性。

前体NODAGA-PEG₄-LLP2A按照课题组前期报道的方法合成并稍作改进。在新前体中，使用Fmoc-NH-PEG₄-CH₂CH₂-COOH替代Fmoc-NH-PEG₄-CH₂COOH；为调节药代动力学性质，使用更亲水的螯合剂NODAGA替代p-SCN-Bn-NOTA。HPLC纯化后，前体化学纯度超过95%。高分辨质谱确认前体分子量，实测值与理论值高度一致（1543.8046 vs 1543.8048），确认合成成功（Fig. S1）。

⁶⁸Ga-LLP2A的标记流程简便高效：将NODAGA-PEG₄-LLP2A与⁶⁸GaCl₃在醋酸钠缓冲液中混合，100°C加热10 min即完成标记。放射化学产率超过99%（Fig. 1A），无需进一步纯化即可直接使用。合成结束时摩尔活度为37 ± 10 MBq/nmol（n = 8）。

体内外稳定性测试显示，⁶⁸Ga-LLP2A在PBS和FBS中37°C孵育至2 h均未见明显⁶⁸Ga解离（Fig. 1B, C）；在大鼠尿液中也未检测到解离的⁶⁸Ga（Fig. 1D）。结果表明该示踪剂稳定性良好，适合在体评估。

Western blot分析显示，大鼠单核细胞中整合素α4和β1的表达水平远高于大鼠心肌细胞系H9C2（Fig. 2A, B），因此单核细胞预期对探针有更高的摄取响应。

细胞摄取实验表明，⁶⁸Ga-LLP2A在单核细胞中的摄取随时间逐渐增加，1 h达到峰值（2.71 ± 0.38%），各时间点摄取率分别为0.63 ± 0.20%（15 min）、1.60 ± 0.28%（0.5 h）、2.71 ± 0.38%（1 h）和1.31 ± 0.19%（2 h）（Fig. 2C; Table S1）。H9C2细胞1 h摄取率仅为0.41 ± 0.20%，显著低于单核细胞（P < 0.001）。

1 h后的摄取下降反映了探针与VLA-4特异性结合后的动态细胞处理过程。VLA-4在配体结合后发生受体介导的内化，将表面结合的探针从细胞膜移除；内化后的探针可能被转运至溶酶体降解，导致放射性代谢物释放出细胞；此外，配体-受体结合的可逆性也导致探针在孵育过程中的解离和洗脱。这些动力学特征在整合素靶向示踪剂中已有充分报道。

细胞阻断实验进一步证实了靶向特异性：用过量游离LLP2A预处理后，单核细胞对⁶⁸Ga-LLP2A的摄取显著降低（P < 0.001）。综合以上结果，⁶⁸Ga-LLP2A在体外具有良好的VLA-4亲和力和靶向特异性。

在将探针应用于心脏移植大鼠前，研究团队首先在VLA-4过表达的B16F10荷瘤小鼠中评估⁶⁸Ga-LLP2A的体内靶向效率和特异性。PET/CT静态成像显示，注射后0.5、1和2 h所有肿瘤均可清晰显影，肿瘤滞留高（Fig. 3A）；阻断组小鼠肿瘤内几乎无放射性浓聚，证明其VLA-4靶向特异性良好。膀胱清晰显影，确认该示踪剂主要通过泌尿系统代谢。

离体生物分布分析与PET成像结果一致（Fig. 3B, C; Table S2）。2 h时，肿瘤摄取达4.44 ± 1.08% ID/g，肿瘤/血液比值为15.20 ± 2.64，肿瘤/肌肉比值为17.56 ± 2.34，肿瘤/心脏比值为20.77 ± 2.79，肿瘤/肺比值为2.81 ± 0.52；阻断组各项指标均显著降低（0.43 ± 0.39% ID/g, P < 0.001; 3.05 ± 0.67, P < 0.0001; 6.48 ± 1.95, P < 0.001; 4.69 ± 2.04, P < 0.0001; 1.73 ± 0.24, P < 0.01）。此外，脾脏和骨骼摄取相对较高，这与VLA-4在淋巴细胞、单核细胞和造血祖细胞中的生理性表达一致，阻断实验确认了这种摄取的特异性。

在确认体内靶向效率后，研究团队将⁶⁸Ga-LLP2A应用于心脏移植后5天的大鼠模型。各实验组包括：同种异体移植组（ALL）、同种异体移植+阻断组（ALL-B，共注射过量未标记LLP2A）、同种异体移植+环孢素A治疗组（ALL-T）、同基因移植组（ISO）和正常Lewis大鼠（NOR），每组5只。

注射⁶⁸Ga-LLP2A（5.5-7.4 MBq/只）后1 h行PET/CT静态扫描。ALL组移植心脏在冠状位、矢状位和横断位均清晰显影，放射性浓聚显著（Fig. 4）；ALL-T组移植心脏的放射性摄取明显降低；ALL-B组阻断后移植心脏的示踪剂摄取显著低于未阻断的ALL组；ISO组和NOR组腹部未见放射性浓聚。这些结果表明，⁶⁸Ga-LLP2A能够反映移植心脏中VLA-4的表达水平差异，具有区分排斥与非排斥状态的潜力。

离体放射自显影进一步验证了PET/CT成像结果。ALL组移植心脏的⁶⁸Ga-LLP2A摄取显著高于自体心脏（3.86 ± 0.06 vs 0.25 ± 0.01, P < 0.001）（Fig. 5; S2B）。定量分析显示，ALL组移植心脏摄取值显著高于ALL-B组（0.37 ± 0.02, P < 0.001）、ALL-T组（2.99 ± 0.03, P < 0.001）和ISO组（0.76 ± 0.03, P < 0.001）。

与ALL组相比，ALL-B组移植心脏、肝脏和脾脏的放射性摄取均显著降低，示踪剂摄取值接近背景水平，阻断效应显著。除ALL-B组外，各组间自体心脏、肝脏、脾脏和双侧肾脏的摄取值无显著差异。

为深入评估⁶⁸Ga-LLP2A的体内代谢和特异性，PET/CT扫描后1 h处死所有模型大鼠，对感兴趣组织进行生物分布研究（Fig. 6; Table S3）。

除ALL-B组外，脾脏是所有组中⁶⁸Ga-LLP2A摄取最高的器官（3.01 ± 0.27、2.28 ± 0.27、2.32 ± 0.44和2.06 ± 0.13% ID/g），其次为肾脏，表明该示踪剂主要通过肾脏代谢。

关键发现是移植心脏的摄取差异：ALL组移植心脏摄取值（1.23 ± 0.16% ID/g）显著高于ALL-B组（0.19 ± 0.03% ID/g, P < 0.001）、ALL-T组（0.78 ± 0.16% ID/g, P < 0.01）、ISO组（0.34 ± 0.16% ID/g, P < 0.001）和NOR组自体心脏（0.15 ± 0.16% ID/g, P < 0.001）。生物分布结果与PET/CT成像和放射自显影一致，提示该探针可用于AR的早期诊断。

H&E染色显示ALL组和ALL-B组出现大量淋巴细胞浸润和心肌细胞坏死，两组间无显著差异（Fig. 7A）。ALL-T组经CsA治疗后排斥反应显著减轻，仅见轻度淋巴细胞浸润。ISO组作为阴性对照，未见淋巴细胞浸润或心肌损伤。

免疫荧光染色显示，ALL组移植心肌中大量VLA-4阳性细胞浸润，整合素α4和β1的荧光强度显著高于ISO组、ALL-T组和NOR组自体心脏（Fig. 7B）。ALL-B组的VLA-4阳性细胞浸润与ALL组无显著差异，说明阻断仅影响探针结合而不改变VLA-4表达本身。CD3⁺T淋巴细胞和CD11b⁺髓系细胞浸润与VLA-4共定位，ALL组和ALL-B组浸润丰富，而ALL-T、ISO和NOR组仅见轻度浸润（Fig. 7C）。

重要的是，生物分布研究中各心脏的⁶⁸Ga-LLP2A摄取值与免疫荧光中整合素α4、整合素β1、CD3（T淋巴细胞）和CD11b（髓系细胞）的阳性面积百分比呈正相关（Fig. 7D）。这些结果表明，⁶⁸Ga-LLP2APET/CT成像真实反映了移植心脏的病理改变，为该影像学方法的临床应用潜力提供了有力支撑。

本研究成功构建了靶向VLA-4的⁶⁸Ga-LLP2APET分子探针，并首次将其应用于移植排斥领域。

在探针设计层面，NODAGA-PEG₄-LLP2A在酸性条件下10 min即可与⁶⁸Ga高效络合，放射化学纯度高，标记方法简便、快速且高效。体外研究表明⁶⁸Ga-LLP2A在VLA-4高表达的单核细胞中呈高摄取，在VLA-4低表达的H9C2心肌细胞中摄取较低，且阻断实验证实了良好的靶向特异性。B16F10荷瘤小鼠实验进一步验证了体内靶向效率和特异性，结果与课题组前期报道的未修饰示踪剂⁶⁸Ga-NOTA-PEG₄-LLP2A及Beaino等报道的⁶⁸Ga/⁶⁴Cu标记LLP2A偶联物一致，证明结构修饰不改变靶向效率和特异性。

在PET成像层面，与课题组前期开发的⁹⁹ᵐTc-HYNIC-mAbCD4单抗探针相比，⁶⁸Ga-LLP2A的小肽结构有利于快速靶向VLA-4并经肾脏迅速清除，注射后1 h即可获得高移植物/背景比，成像时间窗更短，更有利于临床转化。ALL-T组经CsA治疗后摄取值显著降低，提示探针可通过追踪VLA-4表达水平可视化排斥严重程度。

在组织学验证层面，免疫荧光显示VLA-4阳性细胞与CD3⁺T淋巴细胞和CD11b⁺髓系细胞共定位，且探针摄取值与各免疫标志物阳性面积正相关，从病理学角度证实了⁶⁸Ga-LLP2APET成像反映的是真实的排斥反应病理改变。

本研究也存在局限性。首先，考虑到AR发展中募集免疫细胞的表型多样性，VLA-4在AR发展中的具体功能机制仍有待进一步研究。其次，本研究仅在大鼠异位心脏移植模型中验证，⁶⁸Ga-LLP2A在人体中的药代动力学、安全性和诊断效能需进一步探索。

本研究成功构建了靶向VLA-4的⁶⁸Ga-LLP2APET分子探针，并首次将其应用于移植排斥领域。⁶⁸Ga-LLP2A标记简便高效、体内外稳定性好，在VLA-4高表达细胞中呈高摄取且可被阻断；B16F10荷瘤小鼠实验验证了体内靶向效率和特异性；在大鼠腹部异位心脏移植模型中，ALL组移植心脏PET/CT成像清晰显影，阻断和治疗组摄取显著降低，同基因移植组和正常组无摄取；放射自显影、生物分布和免疫荧光染色结果一致，且探针摄取值与VLA-4及炎症标志物表达水平正相关。⁶⁸Ga-LLP2A有望成为急性心脏排斥反应无创早期诊断的候选探针。

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