PBJ | 中国科学院武汉植物园辛海平团队揭示VvbHLH30-VvERF70-VvACS2模块调控葡萄低温乙烯合成的分子机制

1. 乙烯参与葡萄低温应答并正调控其抗寒性

研究人员首先证实了低温（4°C）处理能迅速诱导葡萄根系中乙烯的前体ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）含量和乙烯释放速率的显著升高（图1）。外源施用ACC可增强根系抗寒性，而施用乙烯合成抑制剂AVG则降低抗寒性，证实乙烯在葡萄冷驯化中发挥正向调控作用。

2.VvACS2是调控葡萄低温下乙烯生物合成的关键基因

ACC合成酶（ACS）是乙烯生物合成途径中的限速酶，由多基因家族编码。通过全基因组鉴定获得9个VvACS家族成员，并结合低温处理下葡萄根系的转录组数据，筛选出响应低温的候选基因VvACS2、VvACS4和VvACS6。研究团队利用发根农杆菌介导的转基因体系，在葡萄根中分别过表达和敲除这三个基因。结果表明，只有VvACS2的过表达能显著促进ACC积累和乙烯生成，并导致根系出现短小表型；而敲除VvACS2则抑制了低温诱导的乙烯合成，并显著削弱了转基因根系的抗寒性，相比之下，VvACS4和VvACS6的功能缺失并未引起类似变化（图2）。这些证据表明，VvACS2是葡萄冷胁迫下负责乙烯生物合成的关键基因。

3. VvERF70和VvbHLH30直接激活VvACS2转录，且正调控低温下乙烯的合成

为解析VvACS2的上游调控机制，研究人员整合转录组数据、共表达网络分析和顺式作用元件预测，筛选出6个候选上游转录因子。通过酵母单杂交、双荧光素酶报告系统和电泳迁移率实验，发现VvERF70与VvbHLH30能够直接结合VvACS2启动子并激活其表达。过表达VvERF70或VvbHLH30可显著上调VvACS2表达，提高ACC含量和乙烯释放速率，从而增强根系的抗寒性。而相反，利用CRISPR-Cas9分别敲除这两个转录因子，则抑制低温下VvACS2表达上调、ACC积累及乙烯生成，转基因根系抗寒性降低（图3）。这些结果表明了VvERF70和VvbHLH30作为VvACS2上游正调控因子发挥作用。

4. VvbHLH30激活VvERF70表达并与VvERF70相互作用，从而增强VvACS2的转录激活，促进乙烯的生物合成

通过酵母双杂交、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）实验，研究人员证实VvbHLH30不仅自身能形成同源二聚体，还能直接与VvERF70蛋白发生相互作用。此外，双荧光素酶报告基因实验显示，当VvbHLH30与VvERF70共同存在时，对VvACS2启动子的激活能力显著增加，展现出协同增效效应（图4）。进一步的机制解析发现，VvbHLH30不仅与VvERF70互作，还能直接结合到VvERF70的启动子上，激活其转录。在vvbhlh30突变体根中，冷诱导的VvERF70表达被显著抑制，证实了VvERF70是VvbHLH30的直接下游靶基因（图4）。乙烯处理实验则显示，外源乙烯可诱导VvERF70表达，但对VvbHLH30无影响。

5. 总结与展望

综上，该研究提出了一个完整的VvbHLH30-VvERF70-VvACS2层级调控模块，系统揭示了葡萄低温应答过程中乙烯合成的转录调控网络。该发现不仅填补了葡萄冷胁迫下乙烯合成调控机制的空白，也为精准提升葡萄及其他作物抗寒性提供了新思路和分子靶点。